中國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó),生態(tài)環(huán)境多樣,作物種類(lèi)繁多,病、蟲(chóng)、草等危害頻繁發(fā)生。農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中必需的生產(chǎn)資料,我國(guó)目前使用的農(nóng)藥以化學(xué)農(nóng)藥為主、生物農(nóng)藥為輔,為促進(jìn)生態(tài)文明建設(shè)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展,研發(fā)和使用無(wú)公害的生物農(nóng)藥得到全社會(huì)的高度重視。生物農(nóng)藥的定義和范疇因不同國(guó)家和不同發(fā)展時(shí)期稍有不同,主要包括植物源農(nóng)藥、動(dòng)物源農(nóng)藥、生物化學(xué)農(nóng)藥和微生物源農(nóng)藥。微生物源農(nóng)藥主要包括活體微生物農(nóng)藥和微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥(microbialmetabolitepesticide,簡(jiǎn)稱(chēng)MMP)。

MMP是以微生物發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物為活性成分、用于防治病蟲(chóng)草等有害生物或調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育的生物農(nóng)藥,主要包括農(nóng)用抗生素、植物免疫誘抗劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。農(nóng)用抗生素具有特定的殺菌或殺蟲(chóng)活性,化學(xué)結(jié)構(gòu)和防治作用機(jī)理明確,如井岡霉素和多抗霉素；植物免疫誘抗劑誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng),增強(qiáng)植物抗病蟲(chóng)害能力,如阿泰靈；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育或抗逆性,如S-誘抗素。

本文總結(jié)了我國(guó)研發(fā)的主要代謝產(chǎn)物農(nóng)藥種類(lèi)、特點(diǎn)和最新研發(fā)與應(yīng)用進(jìn)展,分析了目前研發(fā)與應(yīng)用中面臨的問(wèn)題與挑戰(zhàn),為新型代謝產(chǎn)物農(nóng)藥的研發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1

微生物代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)

微生物代謝產(chǎn)物通常具有如下特點(diǎn)：

(1)化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜,不能或不易通過(guò)化學(xué)方法合成；

(2)生物活性具有選擇性,病原菌對(duì)這些代謝產(chǎn)物不易產(chǎn)生抗藥性；

(3)兼具誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng),提高植物抗病性,且有增產(chǎn)效果；

(4)在土壤環(huán)境中的殘留時(shí)間短,能夠被微生物分解利用；

(5)微生物代謝產(chǎn)物生產(chǎn)原料多為淀粉、糖類(lèi)、玉米漿、黃豆粉等廉價(jià)再生性生物資源；采用發(fā)酵工藝生產(chǎn),廢液和廢水可以回收再利用,對(duì)環(huán)境污染小,同一套設(shè)備略加改造可應(yīng)用于其它菌種的發(fā)酵生產(chǎn),投入成本相對(duì)較低。這些特點(diǎn)決定了微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥與化學(xué)合成農(nóng)藥在研發(fā)、管理、使用和藥效評(píng)價(jià)等方面不能等同。

2

農(nóng)用抗生素

農(nóng)用抗生素是隨著醫(yī)用抗生素的發(fā)展而興起,始于應(yīng)用鏈霉素和土霉素等防治植物病害。日本科學(xué)家從20世紀(jì)60年代開(kāi)始先后研發(fā)出滅瘟素-S、春日霉素、多氧霉素和有效霉素等一系列產(chǎn)品。我國(guó)從20世紀(jì)70年代開(kāi)始先后成功研制并推廣應(yīng)用了10多個(gè)農(nóng)用抗生素品種,包括殺菌劑：農(nóng)用鏈霉素、防線菌酮、滅瘟素-S、井岡霉素、多抗菌素、春雷霉素、寧南霉素、中生菌素、武夷菌素、農(nóng)抗120、公主嶺霉素、四(梧寧)霉素、金核霉素；殺蟲(chóng)/螨劑：瀏陽(yáng)霉素和華光霉素；除草劑：雙丙胺磷；抗雞球蟲(chóng)劑：鹽霉素；殺鼠劑：C/D型肉毒梭菌毒素(表1)。除此之外,下列農(nóng)抗產(chǎn)品在我國(guó)有過(guò)研究或小規(guī)模應(yīng)用,但是由于各種原因沒(méi)有取得登記或大面積推廣,包括殺菌劑：慶豐霉素、那他霉素、滅粉(多米)霉素、天柱菌素、秦嶺霉素、長(zhǎng)川霉素、新奧苷肽、捷安肽素；殺蟲(chóng)/螨劑：南昌霉素、梅嶺霉素、戒臺(tái)素、殺粉蝶菌素。

2.1  井岡霉素(Jinggangmycin)

井岡霉素又稱(chēng)有效霉素(validamycin),是吸水鏈霉菌井岡變種Streptomyces hygroscopicus var. Jinggangensis TH82所產(chǎn)生的氨基糖苷類(lèi)代謝產(chǎn)物(圖1A)。井岡霉素在紋枯菌細(xì)胞內(nèi)被β-D-糖苷酶水解成井岡羥胺,強(qiáng)烈抑制真菌海藻糖酶,干擾能量代謝。沈寅初教授等通過(guò)多種誘變方法獲得高產(chǎn)工程菌株,于20世紀(jì)70年代中期在浙江、江蘇、上海等地產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),廣泛用于水稻紋枯病、棉花立枯病和麥類(lèi)紋枯病等防治。此外,井岡霉素作為一個(gè)天然產(chǎn)物還能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫抗性,可與其他化學(xué)農(nóng)藥或生物農(nóng)藥復(fù)配,因此,井岡霉素是我國(guó)應(yīng)用面積最廣的農(nóng)用抗生素之一。上海交通大學(xué)鄧子新教授團(tuán)隊(duì)克隆了井岡霉素的生物合成基因簇,在變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans TK24中實(shí)現(xiàn)了井岡霉素的異源合成,系統(tǒng)闡明了井岡霉素生物合成機(jī)理。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步闡明了井岡霉素生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制、群體感應(yīng)調(diào)控和溫度調(diào)控機(jī)制,并開(kāi)展了系統(tǒng)的遺傳與代謝改造,將工業(yè)高產(chǎn)菌株中井岡霉素的發(fā)酵效價(jià)提高了20%左右,降低了井岡霉素的生產(chǎn)和使用成本。

2.2  阿維菌素(avermectin)

阿維菌素是1975年從阿維鏈霉菌Streptomyces avermitilis中分離得到的十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)聚酮化合物,因其高效殺蟲(chóng)活性而被廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)上。阿維菌素包含8個(gè)組分,組分A1a、A2a、B1a和B2a占80%～90%,組分A1b、A2b、B1b和B2b占10%～20%,其中B1a殺蟲(chóng)活性最有效(圖1B)。我國(guó)的阿維菌素研究始于1984年,上海市農(nóng)藥研究所從廣東揭陽(yáng)土壤中分離篩選得到阿維菌素產(chǎn)生菌7051。沈寅初教授主持阿維菌素研發(fā)工作,證實(shí)了其在農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)上的應(yīng)用潛力。北京農(nóng)業(yè)大學(xué)李季倫教授通過(guò)誘變育種、代謝工程等技術(shù)提高了阿維菌素的發(fā)酵效價(jià),通過(guò)改進(jìn)提取技術(shù),使阿維菌素的質(zhì)量得到顯著提高。最近,中國(guó)科學(xué)院微生物研究所等單位采用合成生物學(xué)策略控制三磷酸甘油脂動(dòng)態(tài)降解,所得工程菌株在180升工業(yè)規(guī)模發(fā)酵罐中B1a組分的發(fā)酵效價(jià)提高了50%,進(jìn)一步降低了阿維菌素的生產(chǎn)成本。中國(guó)目前已是阿維菌素最大生產(chǎn)國(guó),在該產(chǎn)品研發(fā)與應(yīng)用過(guò)程中有3個(gè)鮮明的特點(diǎn)：

(1)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)；

(2)國(guó)際領(lǐng)先的生物合成機(jī)理研究和高產(chǎn)工程菌株改造技術(shù)；

(3)國(guó)際市場(chǎng)話語(yǔ)權(quán)。

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(簡(jiǎn)稱(chēng)″甲維鹽″)是以發(fā)酵產(chǎn)品阿維菌素B1為中間體化學(xué)衍生的一種新型高效殺蟲(chóng)劑和殺螨劑。與阿維菌素相比,甲維鹽增加了對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性,殺蟲(chóng)譜變寬,對(duì)溫血?jiǎng)游锏亩拘宰兊?不易產(chǎn)生抗藥性。

2.3  多殺霉素(spinosad)

多殺霉素是刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa發(fā)酵液中提取的一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)高效殺蟲(chóng)代謝產(chǎn)物(圖1C),商業(yè)化的產(chǎn)品是spinosyn A和spinosyn D的混合物,故稱(chēng)其為多殺霉素。多殺霉素可以持續(xù)激活靶標(biāo)昆蟲(chóng)乙酰膽堿煙堿型受體,也可以影響γ-氨基丁酸受體,導(dǎo)致害蟲(chóng)迅速麻痹、癱瘓,最后導(dǎo)致死亡。多殺霉素對(duì)靶標(biāo)昆蟲(chóng)具有獨(dú)特的快速觸殺和攝食毒性,可以有效防治小菜蛾、甜菜夜蛾等多種鱗翅目害蟲(chóng),而對(duì)哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)等幾乎沒(méi)有毒性,因此,兼具化學(xué)農(nóng)藥的速效性和生物農(nóng)藥的安全性,具有低殘留、快速降解等優(yōu)點(diǎn)。合成多殺霉素的基因簇共有23個(gè)基因,長(zhǎng)約80 kb,其生物合成包括大環(huán)內(nèi)酯的合成和修飾、鼠李糖及福樂(lè)糖胺的合成與連接等環(huán)節(jié)。乙基多殺菌素是通過(guò)化學(xué)修飾衍生而來(lái)的一種新型多殺霉素類(lèi)殺蟲(chóng)劑,安全性和防治效果更佳。我國(guó)多家研究機(jī)構(gòu)一直在研究多殺霉素生物合成與調(diào)控機(jī)理,構(gòu)建了一系列高產(chǎn)工程菌株,目前已由相關(guān)企業(yè)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

2.4  申嗪霉素(Shenqinmycin)

申嗪霉素是假單胞菌Pseudomonas代謝產(chǎn)物吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid,PCA)的商業(yè)名稱(chēng)(圖1D)。莽草酸途徑的終產(chǎn)物分支酸是申嗪霉素生物合成前體；基因簇phzABCDEFG編碼的7個(gè)酶負(fù)責(zé)協(xié)作完成從分支酸到申嗪霉素的轉(zhuǎn)化。基于申嗪霉素生物合成機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以許煜泉教授為核心的上海交通大學(xué)研發(fā)團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了一系列的遺傳、代謝與合成生物學(xué)改造,所得工程菌株申嗪霉素發(fā)酵效價(jià)可達(dá)到10 g/L左右。相關(guān)企業(yè)優(yōu)化了高產(chǎn)工程菌株的大規(guī)模發(fā)酵條件,發(fā)明了一套水基化酶法綠色提取工藝,研制出環(huán)境友好的1%申嗪霉素懸浮劑劑型。截至2016年,1%申嗪霉素懸浮劑獲得防治9種作物病害(水稻紋枯病、稻瘟病、稻曲病、小麥全蝕病、赤霉病、甜椒疫霉病、西瓜枯萎病、黃瓜灰霉病、霜霉病)農(nóng)藥登記證,應(yīng)用于主糧和經(jīng)濟(jì)作物病害防治。

申嗪霉素的研發(fā)獲得了上海市科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)、教育部科技進(jìn)步獎(jiǎng)(推廣類(lèi))二等獎(jiǎng)。申嗪霉素在病原菌中的作用靶標(biāo)兼具多樣性和特異性。申嗪霉素處理顯著提高水稻白葉枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)活性氧的積累,降低過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性,改變胞內(nèi)氧化還原態(tài)平衡和碳水化合物代謝；水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)經(jīng)申嗪霉素半致死劑量連續(xù)處理30代,沒(méi)有出現(xiàn)抗藥性。申嗪霉素及其衍生物吩胺霉素抑制水稻紋枯病菌幾丁質(zhì)合成酶活性和線粒體中的電子傳遞和氧化磷酸化。經(jīng)0.1～1μmol/L吩胺霉素處理后,水稻對(duì)稻瘟病菌Magnaporthe grisea的抗性、大豆對(duì)立枯病菌Rhizoctonia solani Kuhn的抗性都顯著增強(qiáng)。吩胺霉素對(duì)小麥赤霉病菌Fusarium graminearum的生長(zhǎng)抑制作用明顯,作用靶標(biāo)之一為組蛋白乙酰化酶。

2.5  武夷菌素(Wuyiencin)

武夷菌素是小白鏈霉菌武夷變種Streptomyces albulus var. wuyiensis產(chǎn)生的多組分代謝產(chǎn)物,主要是武夷菌素a和b。組分a通過(guò)紅外光譜、碳譜、氫譜分析,確定其分子式C₁₃H₂₁N₃O₁₄,為一種含有胞苷骨架和過(guò)氧鍵的核苷類(lèi)抗生素(表1),屬于一種結(jié)構(gòu)全新、具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型農(nóng)用抗生素。此外,武夷菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵液中還含有ε-聚賴(lài)氨酸、苯甲酸、間苯二甲酸和黃酮類(lèi)化合物等代謝產(chǎn)物(圖1K,J),因而具有較強(qiáng)的抑菌活性。武夷菌素防治植物病原真菌的作用機(jī)制包括兩個(gè)方面：一是直接抑制病原菌生長(zhǎng)以及分生孢子萌發(fā)；二是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防御相關(guān)酶(如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶),提高植物自身的抗病性。近年來(lái),中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所與相關(guān)企業(yè)合作,建立了該有效成分分離純化的新方法；克隆了武夷菌素生物合成基因簇,闡明了武夷菌素生物合成機(jī)理；采用增加主效基因表達(dá)等策略,創(chuàng)建了武夷菌素產(chǎn)生菌高效遺傳轉(zhuǎn)化體系,定向選育了多株高產(chǎn)武夷菌素工程菌株。在此基礎(chǔ)上,建立了武夷菌素與其他生物農(nóng)藥、化學(xué)農(nóng)藥協(xié)同應(yīng)用的技術(shù)模式,并在黑龍江、天津、青海等地開(kāi)展示范應(yīng)用,對(duì)蔬菜灰霉病、白粉病、葉霉病等真菌病害的防治效率在85%以上。

2.6  中生菌素(Zhongshengmycin)

中生菌素是淡紫灰鏈霉菌海南變種Streptomyces lavendulae var. hainanensis產(chǎn)生的一種N-糖苷類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物,含有6個(gè)同系物類(lèi)有效成分,各組分之間依次遞增一個(gè)β-賴(lài)氨酸(圖1E)。我國(guó)相關(guān)研究單位在產(chǎn)生菌分離篩選和鑒定、高產(chǎn)菌株選育、作用機(jī)制、合成調(diào)控基因、發(fā)酵工藝和后處理技術(shù)、田間應(yīng)用等方面開(kāi)展了系統(tǒng)研究,成功將其研發(fā)成一種應(yīng)用較廣泛的微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥。中生菌素主要是通過(guò)抑制菌體蛋白質(zhì)的合成而起到抑制病原菌的作用,也對(duì)真菌孢子形成和萌發(fā)具有強(qiáng)烈的抑制作用。中生菌素還能與植物互作,提高植物防衛(wèi)反應(yīng)的主要酶系如過(guò)氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、查爾酮合成酶的活性,誘導(dǎo)植物抗病性。中生菌素是目前防治細(xì)菌性病害的特效藥劑之一,主要用于防治水稻白葉枯病、番茄青枯病、黃瓜細(xì)菌性角斑病、煙草野火疫、梨火疫病等,同時(shí)對(duì)部分真菌性病害也具有良好的防治效果,防效在60%～80%。

2.7  春雷霉素(Kasugamycin)

春雷霉素是土壤放線菌春日鏈霉菌Streptomyces kasugenesis產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,分子結(jié)構(gòu)包含3部分：D-肌醇、春日霉胺和亞氨基醋酸側(cè)鏈(圖1F)。1964年我國(guó)從江西泰和縣的土壤中也發(fā)現(xiàn)了春日鏈霉菌,于1970年由中國(guó)科學(xué)院微生物所研制成功并命名為春雷霉素,后發(fā)現(xiàn)與日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的春日霉素結(jié)構(gòu)相似。春雷霉素干擾病原菌蛋白質(zhì)合成過(guò)程中氨酰-tRNA與核糖體結(jié)合,從而阻止氨基酸形成肽鏈,抑制蛋白質(zhì)生物合成,主要用于防治稻瘟病、高粱炭疽病、黃瓜真菌性和細(xì)菌性病害、番茄真菌性和細(xì)菌性病害以及馬鈴薯環(huán)腐病等。

2.8  寧南菌素(Ningnanmycin)

寧南霉素是諾爾斯鏈霉菌西昌變種Streptomyces noursei var. xichangensis產(chǎn)生的一類(lèi)代謝產(chǎn)物,活性成分為胞嘧啶核苷肽型抗生素(圖1G),能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白,降低植物體內(nèi)病毒粒體濃度,破壞病毒粒體結(jié)構(gòu)。寧南霉素低毒,獲得國(guó)家AA級(jí)綠色食品生產(chǎn)資料認(rèn)證,在深層發(fā)酵過(guò)程中還產(chǎn)生17種氨基酸、多種微量元素和維生素,對(duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育具有明顯的調(diào)節(jié)和促生作用,從而改善農(nóng)作物品質(zhì)和提高產(chǎn)量。寧南霉素兼具預(yù)防和治療作用,是我國(guó)首例能防治植物病毒病的農(nóng)抗產(chǎn)品,對(duì)細(xì)菌和真菌性病害也有防治效果。

2.9  多抗霉素(Polyoxin)

多抗霉素又稱(chēng)多氧霉素、多效霉素。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所1967年從安徽合肥土壤中分離的一株金黃色鏈霉菌Streptomyces aureus,產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物與日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的多氧霉素的兩個(gè)組分相似,1978年定名為多抗霉素。多抗霉素含有A至N共14種不同同系物的混合物,為肽嘧啶核苷酸類(lèi)化合物,主要成分是多抗霉素A和多抗霉素B(圖1H),屬于廣譜性抗生素類(lèi)殺菌劑。多抗霉素對(duì)由幾丁質(zhì)為基質(zhì)構(gòu)成細(xì)胞壁的子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、半知菌門(mén)的一些真菌病害有良好防效,尤其是對(duì)鏈格孢屬真菌、絲核菌屬真菌、宮部旋孢腔菌防效顯著,具有安全、高效、內(nèi)吸性強(qiáng)、藥效穩(wěn)定和速效等特點(diǎn)。

2.10  四霉素(Tetramycin)

四霉素又名梧寧霉素,不吸水鏈霉菌梧州變種Streptomyces ahygroscopicus var. wuzhouensis的發(fā)酵代謝產(chǎn)物,含有A1、A2、B和C四個(gè)組分。A1和A2為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)四烯抗生素,B組分為肽類(lèi)抗生素,C組分屬含氮雜環(huán)芳香族衍生物(表1)。15%四霉素水劑對(duì)人、畜和環(huán)境安全,殺菌譜廣,適用于多種作物的真菌和細(xì)菌性病害,對(duì)鞭毛菌、子囊菌和半知菌亞門(mén)真菌等三大門(mén)類(lèi)26種已知病原真菌有殺滅作用。此外,四霉素還能促進(jìn)愈傷組織愈合,促進(jìn)弱苗根系發(fā)育,提高作物抗病能力和品質(zhì)。

2.11  公主嶺霉素(Gongzhulinmycin)

公主嶺霉素又名農(nóng)抗109,不吸水鏈霉菌公主嶺新變種Streptomyces ahygroscopicus var. gongzhulingensis產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,主要成分為脫水放線酮、異防線酮、奈良霉素B、制霉菌素、苯甲酸和熒霉素6種組分混合的多組分農(nóng)用抗生素(表1),可用固體發(fā)酵法生產(chǎn)。0.215%可濕性粉劑主要針對(duì)禾谷類(lèi)黑穗病、水稻惡苗病、稻曲病等種傳病害,在小麥、高粱、谷子、玉米、水稻和蔬菜等作物播種前用公主嶺霉素悶種、浸種或拌種處理即可。

2.12  農(nóng)抗120(Agro-antibiotic 120)

農(nóng)抗120是吸水刺孢鏈霉菌北京變種Streptomyces hygrospinosis var. beijingensis產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,是一種混合型抗菌素,抗病譜廣,直接抑制病原菌蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致病菌死亡。此外,2%～4%水劑對(duì)白粉病、瓜果和蔬菜炭疽病、西瓜枯萎病以及水稻紋枯病具有顯著的防治效果,也可以提高作物的抗病能力和免疫能力,具有保護(hù)和治療雙重效果。與其他傳統(tǒng)的殺菌劑代森錳鋅、多菌靈、百菌清混配聯(lián)用,可以有效增強(qiáng)這些殺菌劑的防治效果,從而減少其使用量。農(nóng)抗120由水溶性和脂溶性組分組成,水溶性組分推測(cè)是一種堿性核苷類(lèi)化合物；脂溶性組分的一種是茴香霉素(圖1I),另外一種組分是四烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素四霉素。最近,王俊博等基于基因組挖掘發(fā)現(xiàn)農(nóng)抗120活性成分還包括制霉菌素和豐加霉素(圖1K,J)。

2.13  華光霉素(Huaguangmycin)

華光霉素又稱(chēng)尼柯霉素(Nikkomycin),從蘇州地區(qū)土壤中分離的輪枝鏈霉菌產(chǎn)生的具咪唑啉結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物,是一種核苷肽(圖1L),作用靶位在真菌的細(xì)胞壁,可抑制胞壁骨架成分之一幾丁質(zhì)的合成,進(jìn)而抑制了真菌的生長(zhǎng),人和動(dòng)物沒(méi)有細(xì)胞壁,所以具有很好的選擇毒性,對(duì)人、畜和環(huán)境安全,對(duì)作物無(wú)毒害。2.5%可濕性粉劑主要用于防治蘋(píng)果山楂葉螨和柑橘全爪螨,并對(duì)多種真菌有效。

2.14  鹽霉素(Salinomycin)

鹽霉素由白色鏈霉菌Streptomyces albus發(fā)酵產(chǎn)生的聚醚類(lèi)一元羧酸代謝產(chǎn)物,具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(圖1M),是典型的離子載體,它對(duì)細(xì)胞中的陽(yáng)離子,尤其對(duì)K+和Na+的親和力特別強(qiáng),使生物所必需的陽(yáng)離子通過(guò)膜上脂質(zhì)屏障的浸透性增強(qiáng),妨礙細(xì)胞內(nèi)外陽(yáng)離子的傳遞,使細(xì)胞內(nèi)外離子濃度發(fā)生變化,從而影響滲透壓,最終使細(xì)胞崩解,起到殺菌作用。鹽霉素主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、真菌、病毒及瘧原蟲(chóng)有抑制和殺滅作用,預(yù)防球蟲(chóng)病效果為100%,保護(hù)率為100%。本品是被世界各國(guó)廣泛承認(rèn)的抗球蟲(chóng)劑,用于雞球蟲(chóng)病和促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)。

2.15  雙丙氨磷(Bialaphos-sodium)

雙丙氨磷是土壤鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus和綠色產(chǎn)色鏈霉菌Streptomyces viridochromogenes產(chǎn)生的一種三肽代謝產(chǎn)物L(fēng)-2氨基-4-[(羥基)(甲基)膦基]丁酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸鈉鹽(圖1N)。雙丙氨膦是一種非選擇性除草劑,其作用比草甘膦快,比百草枯慢,而且對(duì)多年生植物有效,對(duì)哺乳動(dòng)物低毒,在土壤中半衰期較短(20～30天)。雙丙氨膦本身無(wú)除草活性,在植物體內(nèi)降解成具有除草活性的草丁膦和丙氨酸,與植物體內(nèi)谷氨酰胺合成酶爭(zhēng)奪氮的同化作用,導(dǎo)致游離氨的積累,阻礙谷氨酰胺和其它氨基酸合成,主要用于葡萄、蘋(píng)果、柑橘園中去除多種一年生及多年生的單子葉和雙子葉雜草,以及免耕地、非耕地滅生除草。

2.16  其他在研農(nóng)抗產(chǎn)品

熱穩(wěn)定抗真菌因子(heat stable antifungal factor,HSAF)是由產(chǎn)酶溶桿菌Lysobacter enzymogenes產(chǎn)生的多環(huán)大環(huán)內(nèi)酰胺類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物,由一個(gè)獨(dú)特的大環(huán)內(nèi)酰胺體系、一個(gè)四胺酸結(jié)構(gòu)單元和5,5,6-三環(huán)骨架組成(圖10),其生物合成基因簇包含編碼一個(gè)雜合聚酮合酶/非核糖體肽合成酶以及4個(gè)氧化還原酶在內(nèi)的10個(gè)基因。HSAF通過(guò)作用于神經(jīng)酰胺合成酶來(lái)干擾絲狀真菌鞘脂合成從而抑制靶標(biāo)真菌的生長(zhǎng)。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)和江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所劉鳳權(quán)教授團(tuán)隊(duì)率先根據(jù)HSAF的生物合成機(jī)理和調(diào)控機(jī)制,開(kāi)展了以小分子化學(xué)信號(hào)調(diào)控為核心的遺傳改良和高產(chǎn)工程菌株構(gòu)建,并優(yōu)化了HSAF高產(chǎn)發(fā)酵工藝和提取工藝,最終將HSAF的發(fā)酵效價(jià)從2 mg/L提升到目前的570 mg/L。40 mg/L HSAF水劑對(duì)小麥赤霉病的大田防效達(dá)80%,HSAF凝膠劑和水劑已在12個(gè)省20個(gè)縣梨樹(shù)病害示范應(yīng)用,對(duì)梨樹(shù)腐爛病、黑星病等真菌病害的防效達(dá)到75%以上。

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)團(tuán)隊(duì)從玫瑰黃鏈霉菌Streptomyces roseoflavus中分離到了一種具有廣譜抗真菌活性的氧五烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物Roflamycoin(圖1P),該化合物可以在病原菌細(xì)胞膜上形成跨膜離子通道,導(dǎo)致病原菌死亡,對(duì)17種常見(jiàn)植物病原真菌的半致死劑量(EC50)可達(dá)2.1～7.1 mg/L。基于全基因組測(cè)序,通過(guò)生物信息學(xué)和遺傳學(xué)分析解析了Roflamycoin的生物合成途徑與調(diào)控機(jī)制,并通過(guò)遺傳改造構(gòu)建了高產(chǎn)工程菌株。1,000倍稀釋的Roflamycoin水懸浮劑對(duì)黃瓜白粉病的田間防治效果達(dá)到88.1%。

湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心從1998年開(kāi)始與國(guó)際農(nóng)藥巨頭先正達(dá)公司合作分離微生物源天然產(chǎn)物農(nóng)藥活性化合物,已分離獲得細(xì)菌與真菌資源總數(shù)超過(guò)16萬(wàn)株。對(duì)每個(gè)菌株的搖瓶發(fā)酵都進(jìn)行了多靶標(biāo)生物活性測(cè)定和結(jié)構(gòu)鑒定。2013年,從一株放線菌HBERC-20821發(fā)酵液中分離鑒定出一個(gè)高抗真菌活性的新型32元大環(huán)內(nèi)酯化合物,命名為諾沃霉素(Novonestmycin)(圖1Q)。優(yōu)化培養(yǎng)基后諾沃霉素?fù)u瓶發(fā)酵水平可達(dá)1.5 g/L,采用膜濃縮工藝,諾沃霉素總收率在90%以上,濃縮液經(jīng)噴霧干燥即可制成可濕性粉劑。諾沃霉素對(duì)多種農(nóng)作物真菌性病害,如水稻紋枯病菌、水稻稻瘟病菌、蔬菜灰霉病菌等,具有良好防治活性,室內(nèi)最低抑菌濃度可達(dá)1 mg/L左右。2014-2020年,在湖北省天門(mén)市、咸寧市進(jìn)行了大面積的應(yīng)用示范,在推薦使用濃度下,對(duì)于水稻紋枯病的田間防效可達(dá)85%左右。

米爾貝霉素(Milbemectin)是灰色產(chǎn)色鏈霉菌Streptomyces griseochromogenes和冰城鏈霉菌Streptomyces bingchenggensis產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)天然產(chǎn)物(圖1R),與阿維菌素和伊維菌素(Ivermectin)的結(jié)構(gòu)類(lèi)似。米爾貝霉素作為γ-氨基丁酸激動(dòng)劑,具有優(yōu)良的殺螨、殺內(nèi)寄生蟲(chóng)以及殺線蟲(chóng)活性,對(duì)益蟲(chóng)及害螨的天敵沒(méi)有顯著影響,對(duì)哺乳動(dòng)物的毒害作用非常小,是一種廣譜、高效、安全和易降解的生物殺蟲(chóng)劑。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向文勝教授團(tuán)隊(duì)從冰城鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離出多種米爾貝霉素成分,并公布了其基因組序列。呂振斌等研究了米貝鏈霉菌DSM41911的基因組序列,在其發(fā)酵液中檢測(cè)到了米爾貝霉素B5、E、VM44864和B1等組分,并推測(cè)出相關(guān)組分的生物合成途徑。目前,我國(guó)米爾貝菌素工程菌株的發(fā)酵效價(jià)有待提高。

帕克素(Pekingmycin)是由嗜線蟲(chóng)致病桿菌Xenorhabdus nematophila產(chǎn)生的異香豆素衍生物,對(duì)馬鈴薯晚疫病具有較好的防控效果,目前中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所已成功獲得了高產(chǎn)帕克素的工程菌株。

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微生物源植物免疫誘抗劑

在微生物與植物互作過(guò)程中,植物能夠有效識(shí)別微生物產(chǎn)生和分泌的代謝產(chǎn)物,產(chǎn)生免疫反應(yīng)抵抗微生物侵染,因此,這些微生物產(chǎn)生的天然代謝產(chǎn)物可以用于研發(fā)植物免疫誘抗劑。植物免疫誘抗劑對(duì)農(nóng)作物病蟲(chóng)害沒(méi)有直接的殺滅作用,而是激活植物體內(nèi)分子免疫系統(tǒng),提高植物抗病性,激發(fā)植物體內(nèi)的一系列代謝調(diào)控系統(tǒng),提高抗逆性,促進(jìn)植物生長(zhǎng)和作物增產(chǎn)。

鏈蛋白PeaT1是極細(xì)鏈格孢菌Alternaria tenuissima JH505產(chǎn)生的一個(gè)效應(yīng)蛋白,具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域,能與煙草細(xì)胞膜蛋白PtBP1互作,引起胞內(nèi)多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶活性提升,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶、水楊酸、茉莉酸等植物免疫信號(hào)傳導(dǎo)途徑,提高抗性基因和抗性蛋白的表達(dá)以及植保素的合成,最終增強(qiáng)植物抗性。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所與相關(guān)企業(yè)合作改進(jìn)和優(yōu)化了PeaT1蛋白發(fā)酵工藝、提取工藝和助劑,將該蛋白的生產(chǎn)成本降低了60%,貨架期延長(zhǎng)到2年,突破了植物免疫誘導(dǎo)蛋白規(guī)模化制備和長(zhǎng)期保存的技術(shù)瓶頸。

寡糖類(lèi)物質(zhì)模擬植物病原菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),激活植物的免疫系統(tǒng),增強(qiáng)植物應(yīng)對(duì)病蟲(chóng)害的能力,在生物防治領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。將寡糖與鏈蛋白復(fù)配而成的6%寡糖.鏈蛋白可濕性粉劑于2017年取得正式登記,商品名為阿泰靈,登記作物病害為番茄病毒病和煙草病毒病。阿泰靈在水稻、白菜、西瓜、柑橘、馬鈴薯、番茄、辣椒、生姜、蘋(píng)果、葡萄等多種作物上也具有良好的抗病增產(chǎn)作用。

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微生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是通過(guò)人工合成或利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的活性物質(zhì),與植物激素具有類(lèi)似的生理和生物學(xué)效應(yīng),在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上用于調(diào)節(jié)作物的生長(zhǎng)與發(fā)育過(guò)程,達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)、改善品質(zhì)、增強(qiáng)作物抗逆性等目的。我國(guó)登記使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)繁多,赤霉素是使用面積最廣的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之一,由于其在植物組織中的含量甚微,大規(guī)模生產(chǎn)是利用藤倉(cāng)赤霉菌Gibberellafujikuroi通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生。近年來(lái),我國(guó)自主研發(fā)的微生物源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主要包括S-誘抗素、冠菌素和谷維菌素。

4.1  S-誘抗素(S-Abscisic Acid)

S-誘抗素簡(jiǎn)稱(chēng)為S-ABA,化學(xué)結(jié)構(gòu)式是15碳的以異戊二烯為基本單位的倍半萜羧酸(圖1S),是植物五大內(nèi)源激素之一,也是薔薇色尾孢菌Cercospora rosicola、豆類(lèi)煤污尾孢菌Cercospora cruenta和灰葡萄孢菌Botrytis cinerea等真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物。中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)一株灰葡萄孢霉進(jìn)行遺傳改良,獲得高產(chǎn)S-ABA工程菌株TBC-A,并研制了精準(zhǔn)流加補(bǔ)料發(fā)酵工藝等多項(xiàng)S-ABA液體深層發(fā)酵生產(chǎn)工藝技術(shù)。研究成果經(jīng)相關(guān)企業(yè)進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化,建成了世界首條50噸發(fā)酵罐規(guī)模的S-ABA液體深層發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)線,S-ABA產(chǎn)量達(dá)到6.0g/L以上；采用大孔樹(shù)脂吸附、膜分離技術(shù)等進(jìn)行S-ABA產(chǎn)品提取收集,產(chǎn)品總收率大于93%。

目前已研制開(kāi)發(fā)出多個(gè)S-誘抗素調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)及發(fā)揮免疫誘抗功能的農(nóng)藥制劑新產(chǎn)品,如″1% S-誘抗素可溶粉劑″″0.25% S-誘抗素水劑″″0.1% S-誘抗素可溶液劑″等,獲得90% S-誘抗素原藥及11個(gè)制劑的農(nóng)藥正式登記。2010年,S-誘抗素產(chǎn)品首次獲得了美國(guó)環(huán)保署的EPA登記。S-誘抗素在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、誘導(dǎo)植物抗逆性等方面發(fā)揮著重要作用,主要有以下幾個(gè)方面：

(1)S-ABA作為植物″脅迫激素″,在干旱、低溫、鹽堿、病菌侵害、紫外輻射等逆境脅迫的應(yīng)答中起著重要作用；

(2)S-ABA可促進(jìn)種子和果實(shí)的儲(chǔ)存蛋白和糖分的積累,提高農(nóng)產(chǎn)品和水果的品質(zhì)等；

(3)S-ABA還能控制花芽分化、調(diào)節(jié)花期、促進(jìn)生根、控制株型等。

4.2  冠菌素

冠菌素(Coronatine,COR)是丁香假單胞菌Pseudomonas syringae中的一些致病變種產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,由一個(gè)含α-氨基酸的冠烷酸和一個(gè)含有聚酮結(jié)構(gòu)的冠菌酸通過(guò)酰胺鍵連接而成(圖1T)。COR是丁香假單胞菌等病原菌在侵染植物過(guò)程中產(chǎn)生的一種″利己素″,與植物激素茉莉酸的結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似。低濃度冠菌素對(duì)植物生長(zhǎng)、分化、發(fā)育、次生代謝、抗逆(抗旱性、抗寒性、抗鹽性)和抗病性具有生理調(diào)控效應(yīng),減輕逆境對(duì)植物的傷害；高濃度冠菌素抑制氣孔和質(zhì)外體介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)抗性(stomatal based defense and apoplastic defense),降低植物抗病性。COR誘導(dǎo)棉花葉片葉綠素降解,導(dǎo)致葉片和果實(shí)等器官脫落,有利于棉花的機(jī)械化收獲。目前COR發(fā)酵生產(chǎn)菌株主要包括丁香假單胞菌P. syringae pv. Glycinea 4180和P. syringae pv. tomato,以及惡臭假單胞菌P. putida KT2440等。成都新朝陽(yáng)作物科學(xué)股份有限公司登記了98%冠菌素原藥和0.006%可溶液劑,用于棉花和番茄的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。

4.3  谷維菌素

谷維菌素(Guvermectin)又稱(chēng)德夸霉素(Decoyinine)和狹霉素A(Angustmycin A),是吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus發(fā)酵產(chǎn)生的一種核苷類(lèi)代謝產(chǎn)物(圖1U),具有抗菌和抗腫瘤活性,可以應(yīng)用于農(nóng)作物種植業(yè)。有報(bào)道表明谷維菌素促進(jìn)羅漢果和擬南芥生根；促進(jìn)水稻出苗和根系生長(zhǎng),增加分蘗數(shù)、株高、有效穗數(shù)、稻粒數(shù)和谷粒飽滿(mǎn)度,提高水稻的抗病性、抗逆性和對(duì)灰飛虱的抗蟲(chóng)活性。谷維菌素上述生物學(xué)功能的分子作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。谷維菌素可以提高擬南芥內(nèi)源生長(zhǎng)素IAA的水平,改變水稻中IAA和細(xì)胞分裂素的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,但不僅限于這些信號(hào)途徑。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向文勝教授團(tuán)隊(duì)利用中藥重樓內(nèi)生放線菌NEAU6,建立了谷維菌素的生產(chǎn)工藝、劑型和施用方法,94%谷維菌素原藥和1%種子處理液劑于2021年獲得登記證。

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目前存在的問(wèn)題、發(fā)展趨勢(shì)和前景

我國(guó)農(nóng)藥市場(chǎng)上生物農(nóng)藥占10%～13%,在我國(guó)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展中起到了重要支撐作用,蘊(yùn)含著巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。我國(guó)微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥研發(fā)基礎(chǔ)比較好,但是在創(chuàng)新、登記與應(yīng)用等環(huán)節(jié)面臨挑戰(zhàn),主要表現(xiàn)在兩方面：

(1)產(chǎn)、學(xué)、研、用等環(huán)節(jié)嚴(yán)重脫鉤。我國(guó)缺少生物農(nóng)藥龍頭企業(yè),多數(shù)企業(yè)研發(fā)能力不足,缺乏有效的市場(chǎng)營(yíng)銷(xiāo)策略；從事生物農(nóng)藥相關(guān)研究的科研院所大多關(guān)注基礎(chǔ)研究,對(duì)產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中的問(wèn)題關(guān)注不足；有效的代謝產(chǎn)物農(nóng)藥品種不多,缺乏高效價(jià)的生產(chǎn)菌株和綠色生產(chǎn)工藝,導(dǎo)致代謝產(chǎn)物農(nóng)藥推廣應(yīng)用面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上化學(xué)農(nóng)藥。

(2)我國(guó)微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥登記管理有待進(jìn)一步創(chuàng)新完善。微生物代謝產(chǎn)物源于活體細(xì)胞,在自然界土壤和水體等環(huán)境中經(jīng)歷了長(zhǎng)期的自然選擇,我國(guó)40多年農(nóng)抗應(yīng)用過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生大的毒性事件和交叉抗性風(fēng)險(xiǎn),因此,將天然產(chǎn)物與化學(xué)合成的新物質(zhì)等同登記管理有待商榷。建議根據(jù)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生菌的安全性、代謝產(chǎn)物作用機(jī)理和原藥的毒性級(jí)別,進(jìn)行環(huán)境評(píng)價(jià)和毒理試驗(yàn)分級(jí)管理,科學(xué)地減免登記要求。由于歷史原因和農(nóng)藥登記制度的不斷更新,這些基于微生物代謝產(chǎn)物開(kāi)發(fā)的生物農(nóng)藥雖然種類(lèi)多、防治對(duì)象雜,但它們的防效″好與壞″尚未經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)機(jī)構(gòu)統(tǒng)一的″現(xiàn)場(chǎng)評(píng)比″,因此,難以對(duì)它們的防效和特點(diǎn)做出比較。此外,農(nóng)用抗生素對(duì)土壤微生物中機(jī)會(huì)病原菌的影響應(yīng)該引起重視,建議有關(guān)部門(mén)盡快建立實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)體系和技術(shù)平臺(tái),為指導(dǎo)和加快農(nóng)用抗生素的發(fā)展提供科學(xué)、可靠依據(jù)；對(duì)部分作用機(jī)理明確、不會(huì)導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生耐藥性的農(nóng)抗產(chǎn)品,可以科學(xué)地減免登記要求。

微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥是未來(lái)綠色農(nóng)藥研發(fā)的一個(gè)重要方向。我國(guó)微生物資源豐富,從事微生物遺傳、代謝與合成生物學(xué)研究的隊(duì)伍不斷壯大,研究水平與發(fā)達(dá)國(guó)家處于并跑階段。只要積極穩(wěn)妥推進(jìn)產(chǎn)學(xué)研融合,系統(tǒng)開(kāi)展活性代謝產(chǎn)物篩選與鑒定、生物合成途徑與分子機(jī)理研究,利用現(xiàn)代合成生物學(xué)技術(shù)培育高效價(jià)的生產(chǎn)菌株,集成生物合成與化學(xué)合成技術(shù),研發(fā)綠色生產(chǎn)工藝和農(nóng)藥使用技術(shù),創(chuàng)新登記標(biāo)準(zhǔn)與管理,我國(guó)微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥研發(fā)與應(yīng)用完全可能彎道超車(chē),引領(lǐng)全球生物農(nóng)藥的發(fā)展與應(yīng)用。

來(lái)源：《中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)》2022年第3期

作者：何亞文,李廣悅等